第3章 人卵泡的体外培养(4)

　　第3章 人卵泡的体外培养(4)

　　卵泡培养结果的评定方法

　　几种组织形态学方法可以用来观察卵泡体外发育情况。尽管不同物种卵泡存在差异,但形态学及形态测量学的特征如卵泡存活、窦卵泡腔( antral cavity)的形成、卵母细胞存活和减数分裂能力、卵泡和卵泡内卵母细胞的直径均可以用来评估所有物种卵泡体外发育情况。

　　培养卵泡可以在倒置显微镜下对卵泡直接观察,而培养卵巢皮质组织与此不同,只能将组织处理后进行组织学分析来评估卵泡的发育情况。组织学分析是卵巢组织培养结束后必做的,组织经过甲醛溶液或者 Bouin溶液固定、石蜡包埋然后切片。

　　这些切片放到载玻片上,经苏木精、曙红和 saffran染色后,在光学显微镜下观察卵泡形态及其发育阶段(图3.2)。根据切片的组织学分析,已有几种不同办法用来估算卵泡。

　　卵泡培养的结果

　　在体内,原始卵泡生长的启动需要几个月的时间(86)。但卵巢组织体外培养研究中发现,在体外培养液中添加生长因子后,成人卵巢皮质切片大量的原始卵泡在第一周内就开始生长了(24,27,45),而胎儿卵巢组织中原始卵泡3个星期后才开始生长(16)。

　　在一种无血清、简化的长期培养体系中,从卵泡启动生长到发育到下一阶段需要2个月的时间(18)。培养狒狒(23)和人(12,24,45)卵巢皮质组织1~3周时,30%~35%的存活卵泡发育到次级卵泡。在卵泡体外培养时,次级卵泡的发育与卵母细胞直径的增长没有

　　相关性,这与体内生长一样,在此阶段卵母细胞直径增长有限甚至没有变化。在体外,颗粒细胞增殖及数量的增加可以作为次级卵泡发育的标志,这些卵泡直径的增长微乎其微(23~45)分离的人窦前卵泡培养5天(47)及4周(46)后,经染色发现卵泡直径在220pm(47)与350pm(46)之间。窦前卵泡培养5天后发育到窦卵泡阶段,且能检测到颗粒细胞增殖(47)。窦前卵泡培养4周后,70%形成窦卵泡腔。但也有颗粒细胞出现了闭锁,且卵泡未能发育到早期窦卵泡阶段,这可能是因为培养环境没有达到最佳条件(46)。

　　卵泡的体外培养

　　在培养开始时,分离的人窦前卵泡只有20%含有颗粒细胞紧密包围的卵母细胞,而大部分卵泡中的卵母细胞可能是由于闭锁而变性消失。这一研究表明人类窦前卵泡可以在体外培养发育,并能使卵母细胞生长及颗粒细胞分化,但只能使小部分卵泡发育,效果不理想。

　　目前,只有动物模型小鼠由窦前卵泡培养得到了健康后代(78,80,87)。在动物模型猪上,晚期窦前卵泡培养16天后,卵母细胞直径由90μm变为110μm,且这些卵母细胞中40%具有排出第一极体的发育潜能。有人对直径170μm的牛晚期窦前卵泡进行了培养研究,发现50%的卵泡培养10天后能形成窦卵泡腔(54)。

　　绵羊晚期窦前卵泡培养的研究结果最让人鼓舞:直径在170~190μm的绵羊晚期窦前卵泡培养后有所发育(49,88),这些卵泡培养10天后78%形成了窦卵泡腔(88)。由新鲜和冷冻解冻后的绵羊卵巢组织分离的晚期窦前卵泡培养30天后,直径均由200μm发育到1mm,同时20%的卵泡形成了窦卵泡腔。

　　培养结束后,发现卵母细胞直径由80μm发育到130μm(49)，卵泡培养体系为研究相关的生物学问题提供了有趣的试验模型,以便更好地了解动物和人类生殖生理。要研究的问题包括卵泡的形成、原始卵泡的激活和早期发育调节机制、体外培养具有受精能力的卵母细胞以及早期胚胎的发育。不管研究的最终目的是什么,卵泡体外培养技术最终还是由卵巢体积(物种因素)、卵泡发育的目标阶段和卵泡发生的持续性决定。卵泡培养在临床上有明确的适应证:患全身性癌症的年轻女性、家族性过早绝经患者和需要化疗的自身免疫性疾病重症患者。联合卵巢皮质冷冻与移植或卵泡体外培养能为上述病人生育力保存带来重大突破。

　　得到具有发育潜能的卵母细胞是卵泡培养体系成功的标志,目前只有在动物模型小鼠上实现了这一目标。大型哺乳动物卵泡体外培养技术仍有很多问题需要解决,因此仍需对此做大量研究工作。令人遗憾的是,成人卵巢皮质的卵泡不是研究卵泡培养体系的理想来源,因为卵泡密度可能非常低且不均匀。

　　大型哺乳动物卵巢间质致密且纤维较多,致使分离卵泡难度加大,卵泡培养体系的发展受阻。大型哺乳动物卵泡发育时间长,而维持长时间组织培养存在很多困难,也许可以用类似小鼠卵泡的培养方法来解决大型哺乳动物原始卵泡培养体系存在的问题。最早阶段卵泡生长的需求至今仍不清楚,需进一步明确。为了研究卵泡体外培养条件和探索卵泡培养新途径,研究者更偏爱用胎儿卵巢,这是因为胎儿卵巢卵泡密度高且质地柔软。少数报道称,从胎儿卵巢分离的卵泡体外培养后在形态上可以与体内卵泡相媲美。但细胞在体外培养条件下容易发生遗传改变,因此体外培养卵泡的基因状态令人担忧。

　　长时间培养还可能造成肿瘤细胞的形成及非定向的细胞分化和基因修饰。鉴于此,有人建议体外培养的卵泡应当分析是否出现肿瘤细胞标志物。

　　此外,应当应用分子生物学技术分析卵母细胞正常的甲基化类型。(来源：《不孕症与辅助生殖》)